Wstęp
Jedną z najważniejszych i najistotniejszych zalet mikroskopii elektronowej jako metody badawczej określa sentencja widniejąca na transmisyjnym mikroskopie elektronowym w Departament of Plant Pathology Cornell University, USA – „zobaczyć, to znaczy uwierzyć”. W roku 1939 po raz pierwszy Kausche i wsp. obejrzeli cząstkę wirusa mozaiki tytoniu, od tamtej pory mikroskopia elektronowa (EM) na stałe weszła do zbioru technik badawczych stosowanych w wirusologii roślin. Chociaż w dzisiejszych czasach biologia molekularna dysponuje całym arsenałem specyficznych i bardzo czułych metod wykrywania wirusów, to jednak w wielu przypadkach właśnie techniki EM uważane są za jednoznaczne i ostatecznie dowodzące porażenia roślin przez wirusy, gdyż można te czynniki chorobotwórcze zobaczyć.
Identyfikacja wirusów w mikroskopie elektronowym i ustalenie ich przynależności taksonomicznej są możliwe dzięki zastosowaniu technik immunoelektronomikroskopowych – IEM, służących do wykrywania reakcji serologicznych na poziomie pojedynczych cząstek wirusa jako antygenu i specyficznych przeciwciał surowicy. Pewną wartość diagnostyczną mają również niektóre charakterystyczne inkluzje wirusowe, które można stwierdzić w porażonych komórkach roślin, a także badania immunocytologiczne.
Techniki EM, w tym i techniki IEM, w badaniach negatywowo kontrastowych preparatów in vitro wirusów roślin mogą być wykorzystywane także do oceny czystości i jakości oczyszczonych preparatów wirusowych, jakości i specyficzności nowo wyprodukowanych surowic, wykrywania obecności mieszanych infekcji wirusami, wykrywania wirusów roślin w pojedynczych wektorach, a także służą do badań nad pokrewieństwem serologicznym wirusów. Techniki IEM są bardzo proste, szybkie i czułe lecz wymagają bardzo drogiej aparatury więc stosowane są dopiero wtedy, gdy inne techniki serologiczne zawodzą i wyniki testów są niepewne.
Identyfikacja wirusów roślin, a co za tym idzie i diagnozowanie choroby wirusowej możliwe są przy zastosowaniu metod roślin wskaźnikowych, metod serologicznych oraz technik elektronomikroskopowych.
W mikroskopie elektronowym ustala się przede wszystkim następujące cechy i własności wirusów: morfologię cząstek, ich właściwości serologiczne i pokrewieństwo z innymi wirusami oraz zmiany cytopatologiczne, jakie powstają na skutek porażenia danym wirusem. Do tego celu wykorzystuje się techniki do badań zawiesin wirusów w kontrastowych, negatywowo nieczyszczonych i oczyszczonych preparatach oraz techniki immunoelektronomikroskopowe. Umożliwiają one serologiczne wykrywanie wirusów występujących w bardzo niskich koncentracjach, wykrywanie mieszanin wirusów, a także przez możliwość mianowania surowic dokładnie określanie pokrewieństwa serologicznego. Specjalne znaczenie diagnostyczne mają wyniki badań interakcji wirus – roślina w ultracienkich skrawkach, a zwłaszcza badania inkluzji wirusowych.
1) Techniki elektronomikroskopowe w badaniach negatywowo kontrastowych preparatów in vitro wirusów roślin.
Preparaty in vitro wirusów to zawiesiny wirusów otrzymywane z soku roślin porażonych i te właśnie nadają się na preparaty elektronomikroskopowe. Aby cząstki wirusa były widoczne na błonce siateczki mikroskopu, muszą być wykontrastowane w stosunku do podłoża. W tym celu wykorzystywano techniki cieniowania, napylania wirionów ciężkimi metalami, które obecnie zastąpiono procedurami negatywowego kontrastowania preparatów. Tło staje się ciemniejsze a cząstki wirionów pozostają jaśniejsze. Do technik barwienia negatywowego preparatów in vitro należą:
- technika „mieszania EM” – opracowana przez Williamsa i Backusa w 1949 roku. Polega ona na zmieszaniu preparatu zawierającego wirusa i barwnika w jednakowej objętości i pozostawieniu jej na siatce do wyschnięcia.
- technika zanurzania (dip) zwana zamiennie techniką szybkiego zanurzania (quick-dip) lub zanurzania liścia (leaf-dip) – opracowana przez Brandesa w 1957. Zasada techniki opiera się na tym, że krawędź świeżo przeciętego liścia lub fragment epidermy przeciągany jest kilka razy przez krople wody na szkiełku podstawowym. Część uszkodzonych komórek tonie w kropli, część pozostaje w postaci filmu na powierzchni kropli. Na kroplę nakłada się siateczkę i następnie kontrastuje. Technika ta przeznaczona była do wykrywania wirusów nitkowatych, ale Kitajima (1965), Hitchborn i Hills (1965) oraz Doi i wsp. (1969) wykrywali nią również izomeryczne winiony. Głównym problemem tej metody są zanieczyszczenia zaciemniające obrazy mikroskopowe.
- technika zanurzania w soku (sap-dip) – technika ta wykorzystuje efekt adsorbowania cząstek wirusa na błonkach podtrzymujących. Błonki takie mogą być spłukiwane w celu usunięcia większości roślinnych zanieczyszczeń. Preparaty uzyskuje się przez nałożenie siateczki na krople soku lub odwrotnie po chwili spłukuje się ją wodą destylowaną i następnie kontrastuje. Zaleta metody jest to, że uzyskuje się wyraźniejsze obrazy morfologii cząsteczek, a wadą to, że jakiś ważny materiał może zostać wypłukany. Wykorzystując tę technikę Christie i wsp. (1987) opracowali procedurę CVC (clarifield viral concentrate) stosując wstępne oczyszczanie wirusa przed naniesieniem go na błonkę. Oprócz naprawdę czystych preparatów uzyskali, wielokrotne zwiększenie ilości cząstek wirusowych.
- technika „napięcia powierzchniowego” EM zwana „procedurą
rozszerzania” – wykorzystuje napięcie powierzchniowe kropli wody, aby usunąć z preparatów sole i cukry czyli związki rozpuszczalne w wodzie. Białka i tłuszcze mogą pozostać na powierzchni kropli. Do powierzchni kropli dotyka się błonką siatki, a następnie kontrastuje. Służy ona w preparatyce kwasów nukleinowych w ME.
- technika „agarowa EM” – opisał ją Kellenberger i Bitterli w 1976 roku. W technice tej błonkę podtrzymującą umieszcza się na płytce Petriego, a następnie nanosi się na nią zawiesinę wirusa. Drobne cząsteczki soli i cukrów powinny przeniknąć do agaru. Błonkę wypłukuję się barwnikiem z agaru i umieszcza na siatkach.
2) Techniki immunoelektronomikroskopowe preparatów in vitro.
Badanie reakcji serologicznych między antygenem (wirus roślinny) a specyficznymi przeciwciałami surowicy z wykorzystaniem mikroskopii elektronowej możliwe jest dzięki tak zwanym technikom immunoelektronomikroskopowym – IEM. Techniki immunocytochemiczne umożliwiają lokalizację antygenów w komórkach roślin, za pomocą znakowanych elementarnym złotem przeciwciał. Bardzo wysoka czułość i specyficzność testów, minimalna wielkość próbek badawczych i w zasadzie możliwość wykorzystania prawie każdego rodzaju surowic to najważniejsze zalety tych technik.
- technika IEM dekoracji cząstek – opracowana przez Milne i Luisoni w 1975 roku. Na skutek niespecyficznej adsorpcji cząstki wirusowe są unieruchamiane na powierzchni błonki podtrzymującej. Potraktowanie takich nieruchomych cząsteczek specyficzną surowicą prowadzi do wystąpienia reakcji serologicznej widocznej po kontrastowaniu w postaci opłaszczenia. Warstwa ta pochłania dużo więcej barwnika toteż jest widoczna jako ciemna otoczka. Poszczególne etapy procedury rozdzielone są dokładnym płukaniem siatek, dzięki czemu obrazy elektronomikroskopowe są bardzo wyraźne, dobrze wykontrastowane, bez nadmiaru zanieczyszczeń. Technika dekoracji IEM preparatów in vitro wirusów roślin wykorzystywana jest głównie do identyfikacji wirusów, pomiarów miana surowic, określania pokrewieństwa serologicznego między wirusami, lokalizacji określonych determinant antygenowych na wirionach oraz zwiększania wielkości i kontrastu cząstek w celu ułatwienia identyfikacji wirusa.
- technika immunosorpcyjna ISEM oraz ISEM+dekoracja – opracowana przez K. S. Derricka 1972/1973. Polega ona na serologicznym uczulaniu błonek podtrzymujących. Błonka zostaje pokryta warstwą przeciwciał surowicy i umieszczona na kropli zawiesiny wirusa. Uczulona błonka działa jak pułapka wyłapując z zawiesiny, w drodze reakcji serologicznej, prawie wyłącznie specyficzne antygeny, czyli cząstki wirusa. Dokonano wielu usprawnień tej techniki np. stosowaniem białka A, znakowaniem przeciwciał złotem koloidalnym czy stosowaniem przeciwciał monoklinalnych. Pokrycie siatki mikroskopowej surowicą umożliwia wyłapanie na siatkę wielokrotnie większej - 2 do 30 tys. razy - liczby cząstek. Techniki te służą w diagnostyce wirusów występujących w tak małych koncentracjach, że nie mogą być wykrywane przy pomocy prostych technik negatywowego kontrastowania, np. luteowirusów. Techniką tą możliwe jest badanie serologicznego pokrewieństwa między wirusami i może ona służyć do oznaczeń ilościowych zarówno wirusów, jak i przeciwciał surowicy. Po zmieszaniu surowic można nią wykrywać mieszaniny wirusów. Wynik jak otrzymujemy jest jednoznaczny, bo obserwuje się bezpośrednio winiony, czułość techniki jest podobna jak technik enzymatycznych głównie ELISA. Warstwa surowicy nie dopuszcza do zanieczyszczenia błonki podtrzymującej białkiem rośliny, dzięki czemu cząstki są lepiej widoczne. Można wykorzystywać zarówno poli- jak i monoklinalne surowice. Trudności związane ze stosowaniem techniki ISEM to wysoki koszt wyposażenia i użytkowania pracowni elektronomikroskopowe, co wiąże się z ograniczeniem wielkości i liczebności badanych próbek. Połączenie techniki ISEM z dekoracją powoduje sumowanie zalet obu technik. Umożliwia też zastosowanie dwóch różnych rodzajów przeciwciał na poszczególnych etapach procedury, co bardzo ułatwia i podnosi czułość testów serologicznych w badaniach pokrewieństwa niektórych wirusów.
- technika zbrylania cząstek IEM – Pierwsze reakcje serologiczne obejrzano w mikroskopie elektronowym już w 1941 roku przez Andersona i Stanleya. Efekt reakcji serologicznej między antygenem, czyli wirionami wirusa i specyficznymi przeciwciałami surowicy widoczny jest w mikroskopie elektronowym w postaci zlepionych przeciwciałami cząstek wirusów. Pewne kłopoty natury technicznej w preparatyce jak: wysychanie mieszaniny serologicznej przed kontrastowaniem, krystaliczne osady po stosowanych buforach i często nieodpowiednie związki kontrastujące, powodowały, że z reguły uzyskiwano obrazy nieczytelne, z uszkodzonymi wirionami. Milne i Luisioni (1975,1977b) zaproponowali wersję tej techniki, wprowadzając etap płukania błonek podtrzymujących dzięki czemu uzyskiwano obrazy dużo lepszej jakości. Wykorzystywano ją do identyfikacji wirusów, badań nad pokrewieństwem serologicznym oraz była polecana do mianowania surowic. Obecnie technika ta jest rzadko stosowana, gdyż efekty zbrylania cząstek są czasami niespecyficzne, koncentracja cząstek wirusów musi być stosunkowo wysoka i musi być odpowiednia koncentracja surowic.
3) Badania inkluzji wirusowych w ultracienkich skrawkach.
Patogeneza choroby wirusowej może pociągać za sobą daleko idące zmiany w metabolizmie porażonych komórek roślin. Mogą być one związane z degradacją systemu elementarnych błon komórkowych, zmian strukturalnych organelli itp., co może doprowadzić nawet do śmierci komórki. Występują także zmiany cytologiczne, które mogą być specyficzne i typowe tylko dla rodziny lub rodzaju wirusa i są niezależne od reakcji rośliny żywicielskiej na zakażenie. Lesemann (1991) do takich zmian zalicza nagromadzenie się w komórce różnych produktów genomu wirusa oraz zmiany w systemie błon komórek żywiciela uczestniczących w procesie replikacji, które obserwowane mogą być jedynie krótko po infekcji. Główne produkty genomu wirusa to cząstki wirusów, występujące pojedynczo lub w agregatach oraz różne niestrukturalne białka tworzące duże i charakterystyczne inkluzje wirusowe. Cząstki wirusów, których genomem jest ssRNA, najczęściej występują w cytoplazmie podstawowej, ale także w centralnej wakuoli, plastydach lub mitochondriach. Wirusy o cząstkach izomerycznych najłatwiej rozróżnić, gdy tworzą zwarte masy lub kryształy. Wirusy o cząstkach wydłużonych mogą być obserwowane jako rozproszone masy cząstek, cząstki ułożone szeregowo i przylegające do błon elementarnych (poty-, carlawirusy) lub gdy występują w spłaszczonych, podobnych do płytek agregatach. Agregaty mogą się łączyć tworząc zwarte kryształy (tobamovirusy) lub ciała, inkluzje staśmione (potem-, Carla-, closterowirusy). Cytoplazmatyczne inkluzje wirusowe powstające z kodowanych przez genom wirusa białek niestrukturalnych to głównie ciała X wiązane z infekcją przez wirus mozaiki tytoniu i tobamowirusy oraz cylindryczne inkluzje charakterystyczne dla potywirusów. Funkcja, jaką mają spełniać inkluzje wirusowe, nie jest jeszcze poznana, może ich białko odgrywa jakąś rolę w systemie replikacyjnym RNA lub w transporcie wirusów z komórki do komórki. Edwardson i Christie w 1978 opisali charakterystyczne dla poszczególnych grup wirusów typy inkluzji wirusowych, które mogły być przydatne jako kryteria klasyfikacyjne (pokrewieństwo wirusów) i cechy diagnostyczne grupy.
Mikroskopia elektronowa dominowała w większości prac lat sześćdziesiątych. Lata siedemdziesiąte to dominacja enzymatycznego testu serologicznego ELISA, lata osiemdziesiąte należały do przeciwciał monoklinalnych, zaś w latach dziewięćdziesiątych zeszłego stulecia to fascynacja metodami łańcuchowej reakcji polimerazy – PCR. Zarówno nowe techniki EM, jak i coraz nowocześniejsze mikroskopy mogą odkryć przed nami nie jedną terra incognita mikroświata.
Bibliografia
ADRIAN M., DUBOCHET J., LEPAULT J., MCDOWELL A. W. 1984. Cryo-electron microscopy of viruses. Nature, London 308: 32-36.
ANDERSON F. A., STANLEY W. M. 1941. A study by means of the electron microscope of the reaction between tobacco mosaic virus and its antiserum. J. Biol. Chem. 139: 339-344.
BAKER K. K., RAMSDELL C. D., GILLETT J.M. 1985. Electron microscopy: current applications to plant virology. Pl. Dis. 69: 85-90.
BALEN van E., BOUWEN I. 1995. The electronmicroscope as a diagnostic tool in plant virology. Bull. OEPP/EPPO 25: 233-238.
CHRISTIE R.G., EDWARDSON J.R. 1977. Light and electron microscopy of plant virus inclusions. Florida Agric. Exp. Stn. Monog. 9: 150 str.
CHRISTIE S.R., PURCIFULL D.E., CRAWFORD W.E., AHMED N.A. 1987. Electron microscopy of negatively stained clarified viral concentrates obtained from small tissue samples with appendice on negative staining techniques. Bull. Inst. Food Agr. Sci. Univ. Florida 872: 45 str.
DERRICK K.S. 1973. Quantitative assey for plant viruses using serologically specific electron microscopy. Virology 56: 652-653.
DOI Y., TORIYAMAS., YARA K.,ASUYAMA H. 1969. Direct negative staining method for detection of virus particles in fresh preparations from infected plant tissue. Ann. Phytopath. Soc. Japan 35: 180-187.
EDWARDSON J.R. 1966. Electron microscopy of cytoplasmic inclusions in cells infected with rod-shaped viruses. Amer. J. Bot. 53: 359-364.
EDWARDSON J.R. 1974. Some properties of the potato virus –Y group. Florida Agric. Exp. Stn. Monogr. 4, 398 str.
EDWARDSON J.R. 1992. Inclusion bodies. Archiv. Virol. Suppl. 5: 25-30.
EDWARDSON J.R., PURCIFULL D., CHRISTIE R.G. 1968. Structure of cytoplasmic inclusions in plants infected with rod-shaped viruses. Virology 34: 250-263.
EDWARDSON J.R., CHRISTIE R.G. 1978. Use of virus-induced inclusions in classification and diagnosis. Ann. Rev. Phytopathol. 16: 31-55.
EDWARDSON J.R., CHRISTIE R.G., KO N.J. 1984. Potyvirus cylindrical inclusions – subdivision IV. Phytopathology 74: 1111-1114
EDWARDSON J.R., CHRISTIE R.G. 1996. Cylindrical inclusions. Univ. Florida Agric. Exp. Stn. Inst. Food Agric. Sci. Bull 894: 79 str.
HAMILTON R.I., EDWARDSON J.R., FRANCKI R.I.B., HSU H.T., HULL R.,KOENIG R., MILNE R.G. 1981. Guidelines for the identification and characterization of plant viruses. J. gen . Virol. 54: 223-241.
HITCHBORN J.H., HILLS G.J. 1965. The use of negative staining in the electron microscopic examinations of plant viruses in crude extracts. Virology 27: 528-540.
KITAJIMA E.W. 1965. A rapid method to detect particles of some spherical plant viruses in fresh preparations. J. Electron Microsc. 14: 119-121.
LENT van J.W.M., VERDUIN B.J.M. 1987a. Detection of viral antigen in semi-thin sections of plant tissue by immunogold-silver staining and light microscopy. Neth. J. Pl. Pathol. 93: 261-272.
LENT van J.W.M., VERDUIN B.J.M. 1987b. In situ detection of the translocation of virus in plants. Acta Bot. Nederl. 36: 327.
LENT van J.W.M., VERDUIN B.J.M. 1991. Immunolabelling of viral antigen in infected cells. W. Mendegen K., Lesseman D.E. (wyd.) “Electron microscopy of plant pathogens.” Berlin, Springer-Verlag: 119-131.
LESEMAN D.E. 1979. Immun-Elektronenmikroskopie ein empfindliches und spezifisches Verfahren zur Virusdiagnose. Gesunde Pflanzen 11: 282-286.
LESEMAN D.E. 1988a. Recent aspects of the use of cytopathology in virus identification. Acta Horticult. 234: 289-298.
LESEMAN D.E. 1988b. Cythopathology. W R.G. Milne (wyd.) „The plant viruses” Plenum, New York, Vol. 4: 179-235.
LESEMAN D.E. 1991. Specific cytological alterations in virus-infected plant cells. W. Mendegen K., Lesseman D.E. (wyd.) “Electron microscopy of plant pathogens.” Berlin, Springer-Verlag: 147-159.
LIM T.M., CHNG C.G., WONG S.M. 1996. Study of the three-dimensional images of potyvirus-induced cytoplasmic inclusions using confocal laser scanning microscopy. J. virol. Meth. 60: 139-145.
LUISONI E., MILNE R.G., ACCOTTO G.P., BOCCARDO G. 1987. Cryptic viruses in hop trefoil (Medicago lupulina) and their relationships to other cryptic viruses in Legumes. Intervirology 28: 144-156.
MATHEWS R.E.F. 1981. Plant virology. Acad. Press, N. York, London, 897 str.
MAZZONE H.M., WRAY G., ENGLER W.F. 1985. The high voltage electron microscope in virology. Adv. Virus Res. 30: 43-82.
MILNE R.G. 1984. Electron microscopy for the identification of plant viruses in in vitro preparations. W K. Maramorosch i H. Koprowski (red.) “Methods in Virology” Academic Press, London, 7: 87-120.
MILNE R.G. 1986. New developments in electron microscope serology and their possible applications. W R.A.C. Jones and L. Torrance (red.) “Developments and applications in virus testing”. Wellesbourne, Assoc. Appl. Biol. 1: 179-191.
MILNE R.G. 1991. Immunoelectron microscopy of virus identification. W Mendegen K., Lesseman D.E. (wyd.) “Electron microscopy of plant pathogens.” Berlin, Springer-Verlag: 87-102.
MILNE R.G., LESEMANN D.E. 1984. Immunosorbent electron microscopy in plant virus studies. W K. Maramorosch i H. Koprowski (red.) “Methods in Virology” Academic Press, London, Vol. 8: 85-101.
MILNE R.G., LUISONI E. 1975. Rapie high-resolution immune microscopy of plant viruses. Virology 68: 270-274.
MILNE R.G., LUISONI E. 1977b. Rapid immune electron microscopy of virus preparations. W K. Maramorosch i H. Koprowski (red.) “Methods in Virology” Academic Press, London, 6: 265-281.
ROBERTS I.M. 1984. Freeze-drying and high resolution shadoving of plant virus particles in structural studies. Proc. 8th Europ. Congr. Electron Microsc., Budapest, Hungary, 3: 1805-1806.
ROBERTS I.M., MAYO M.A. 1980 . Electron microscope studies of the structure of the disk aggregate of tobacco rattle virus protein. J. Ultrastruct. Res. 71: 49-59.
ROBERTS I.M., MILNE R.G., van REGENMORTEL M.H.V. 1982. Suggested terminology for virus/antibody interactions observed by electron microscopy. Intervirology 18: 147-149.
SZYNDEL M.S. 1987a. Przegląd technik immunoelektronomikroskopowych stosowanych w wirusologii roślin. I. Obrazy reakcji serologicznej w mikroskopie elektronowym; tradycyjne techniki IEM. Post. Nauk Roln. 1-2: 75-62.
SZYNDEL M.S. 1987a. Przegląd technik immunoelektronomikroskopowych stosowanych w wirusologii roślin. I. Nowoczesne techniki IEM; czułość i zastosowanie technik IEM. Post. Nauk Roln. 4: 75-84.
SZYNDEL M.S. 1992. Trwałość elektronomikroskopowych i immunoelektrono-mikroskopowych preparatów wirusów roślin negatywowo kontrastowanych octanem uranylu oraz praktyczny aspekt stosowania tego „barwnika”. Acta Agrobot. 45: 51-59.
